近日，发酵工程教育部重点实验室(湖北工业大学)汤亚杰课题组应邀在生物工程领域国际顶级学术期刊《Biotechnology Advances》(影响因子为10.597)发表了琥珀酸生物制造研究进展。基于琥珀酸生物制造的重大意义，该论文系统阐述了琥珀酸生物制造研究进展，对未来研究趋势进行了展望。据悉，《Biotechnology Advances》是Elsevier Science出版社旗下的综述性期刊，专注于生物技术领域的研究，在Biotechnology & Applied Microbiology同类期刊中影响因子排名第5位，排在Nature reviews. Drug discovery (影响因子57.000)、Nature biotechnology (影响因子41.667)、Genome research (影响因子11.922)、Trends in Biotechnology (影响因子11.126)之后。
作为一种重要的四碳平台化合物，琥珀酸是生产众多表面活性剂、食品添加剂、药物中间体的原料，在化工、食品、医药等行业得到广泛应用，因此美国能源部将其列为12种最具潜力的大宗生物基化学品之首。琥珀酸可以通过传统的石油化工法和日益兴起的微生物发酵法合成，前者以不可再生的战略资源石油产品作为原料，原料供给不可持续、生产过程环境污染严重，影响了琥珀酸的发展。面对日益枯竭的化石资源和其所产生的严重环境污染,为了经济和社会的可持续发展,必须以可再生的生物质资源替代不可再生的石化资源,以清洁高效的生物炼制加工方式替代污染低效的石油化工技术路线,即利用微生物发酵生产琥珀酸,实现资源利用和物质加工方式的根本改变,从而推动生物基琥珀酸的大规模生产。同时，利用琥珀酸发酵过程耗CO2这一特性,促进CO2减排,缓解温室效应。
汤亚杰课题组长期从事琥珀酸生物制造领域的研究工作，通过系统解析琥珀酸生物合成代谢网络，提出了削弱副产物合成途径和激活琥珀酸合成途径的新策略，建立了代谢网络全局调控策略，显著提升了微生物合成琥珀酸的能力。相关研究成果先后获得2016年湖北省自然科学一等奖、2014年湖北省科技进步一等奖。
在中心碳代谢网络中，副产物合成与目标产物合成互为竞争。因此，在不影响细胞正常生长的前提下，通过阻断或者降低副产物合成途径的碳代谢流，可以使更多代谢流流向目标产物合成途径，从而促进目标产物积累。基于这一理念，课题组在大肠杆菌生物合成琥珀酸的研究中，通过敲除琥珀酸竞争途径中的关键酶基因ldhA(乳酸脱氢酶)、ptsG(葡萄糖磷酸转移酶)、ackA-pta(乙酸激酶-磷酸转乙酰酶)，降低了流向杂酸的代谢流，副产物合成代谢通量由72.2%降低至21.5%。同时发现了代谢流重排后，在不涉及乙醛酸支路基因改造的情况下激活了乙醛酸支路，从而大幅度提高了琥珀酸产量与产率，琥珀酸合成代谢通量由5.6%上升至43.9%(发表论文Metab Eng2013, 20:9-19)。
CO2作为琥珀酸生物合成的必需底物，是决定琥珀酸合成效率的关键因素。CO2被细胞所利用需要经过两个过程——从胞外到胞内的转运过程和进入胞内代谢的固定过程，发酵液中的CO2只能通过被动扩散方式被菌体摄取，导致胞内进行CO2固定反应的量不足，限制了琥珀酸合成。课题组通过在大肠杆菌中表达蓝藻的CO2转运蛋白，使大肠杆菌实现对CO2的主动运输，转运通量提高了1.4倍，解除了底物不足对琥珀酸合成的限制(发表论文ScientificReports2015, 5:17321)。在此基础上，过量表达了CO2固定功能基因，建立了CO2转运与固定的协同表达体系。为了更好地调控多个外源基因表达，进一步通过能量矩阵构建了启动子文库，利用文库对外源CO2转运与固定基因的表达进行精细调控，并对相关CO2代谢途径进行了组合调节，实现了协同表达体系的优化及代谢平衡，琥珀酸产量比出发菌株提高了37.5% (发表论文Biotechnology andBioengineering2016, 113:1531-1541)。
微生物特定表型往往由多个基因共同调控，而且代谢网络具有鲁棒性，因此仅对个别基因或个别代谢途径进行操作难以达到预期效果。据此，课题组通过研究大肠杆菌全局转录因子Cra这一转录核心元件，发现Cra与其效应物FBP(果糖-1,6-二磷酸)之间的亲和力有助于促进琥珀酸合成，亲和力越大即产量越大。因而通过定点突变，使Cra蛋白调控域上发生3个位点突变，增强了其与FBP的结合力，从而进一步激活了CO2固定基因pck和乙醛酸支路的苹果酸合成酶编码基因aceB的表达，并最终促进了琥珀酸的合成(发表论文Biotechnology for Biofuels2016, 9:624)。
基于上述研究进展，汤亚杰教授多次受邀在中国科学院“代谢科学”科学与技术前沿论坛、中国生物工程学会、中国微生物学会、中国化学生物学、中国化工学会等全国性学会上作邀请报告。
附：第一作者简介
朱丽雯，女，1984年出生，高级实验师。2006年于湖北工业大学获生物工程学士学位，2009年于湖北工业大学获发酵工程硕士学位，师从汤亚杰教授。2017年于武汉大学获博士学位。2009年至今于湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室从事“琥珀酸生物制造”研究。近5年来以第一或共同第一作者在国际知名学术期刊Metabolic Engineering(IF=8.142)、Biotechnology and Bioengineering(IF=4.481)、Biotechnologyfor Biofuels(IF=5.203)等发表SCI论文8篇；授权中国发明专利1项；获湖北省自然科学一等奖、湖北省科技进步一等奖、湖北省自然科学二等奖各1项。主持国家自然科学基金“大肠杆菌全局转录因子Cra对琥珀酸生物合成过程中CO2固定基因的调控机制”(21506049)。
